MS-DIAL　チュートリアル

最終編集日：2019年10月1日

はじめに

MS-DIALは、ノンターゲット・メタボローム解析のためのユニバーサル・ツールであり、複数の機器（GC/MS、GC/MS/MS、LC/MS、LC/MS/MS）および複数のMSベンダー（Agilent、Bruker、LECO、Sciex、 Shimadzu、Thermo、およびWaters）に対応しています。このプログラムでは、netCDF（AIA）やmzMLなどの一般的なデータ形式を扱うことができます。さらに、EIスペクトルやMS/MSスペクトルを含むいくつかのMSPファイルをスタートアップ・キットとしてリリースしています。また、MS-DIALの内部には、FiehnラボのGC/MSデータベース（FAME RIインデックスに基づく）と、LC/MS/MSベースのリピドミクス用のin silico保持時間およびMS/MSデータベースがあります。同位体ラベル付き追跡は、LC/MSプロジェクトでも実行できます。
MS-DIALの特徴は、（1）GC/MSとデータインディペンデントのMS/MSの両方を対象としたスペクトルデコンボリューション、（2）ピーク識別の合理化された基準、（3）生データのインポートから統計分析までのすべてのデータ処理ステップのサポート、および（4）ユーザーフレンドリーなグラフィックユーザーインターフェース（GUI）です。
MS-DIALは、JST/NSF SICORP「低炭素社会のためのメタボロミクス」プロジェクトの支援を受けて、有田正規教授のチーム（理研）とOliver Fiehn教授のチーム（UC Davis）との共同研究として開発されました。

津川裕司
hiroshi.tsugawa@riken.jp

Lead developer: Hiroshi Tsugawa (RIKEN)
Main contributors: Diego Pedrosa (UC Davis), Tomas Cajka (Institute of Physiology CAS), Ipputa Tada (NIG), Haruki Uchino (Keio)

alt MS-DIAL screenshot

MS-DIAL tutorial

第1章

MS-DIALとは

現在のMS-DIALは、ノンターゲット・メタボロミクスのためのパイプラインです。図1にワークフローの概要を示しています。（1）MS-DIALを使用したメタボロミクスの最初のステップは、Reifycs file converterまたはProteoWizard msconverterを使用して、ベンダーのフォーマットをABF（analysis base file）フォーマットまたはmzMLフォーマットに変換することです。これについては、この章の最初のセクションで説明します。（2）次のステップでプロジェクトを選択します：現在のMS-DIALプログラムはGC/MS、LC/MS、LC/MS/MS（DDA：data dependent acquisition）、LC/MS/MS（DIA: data independent acquisition (SWATH or All ions）およびLC-Ion mobility tandem MSのパイプラインが実行可能です。ピークピッキング、ディコンボリューション、化合物同定、およびピークアラインメントを含むデータ処理の後、MS-DIALは正規化（LOWESSを含む）および主成分分析（PCA）による多変量解析を実行します。（3）最後に、他のプログラムを使ってさらなる分析を行えるよう、解析結果を表形式（SIMCA-P、MetaboAnalyst、およびMetFamilyなどに対応）や、MS-FINDER、CSI:FingerID、CFM-ID、MetFrag、およびMetFamilyなどによる化合物同定に対応する複数のスペクトル形式（NIST、MassBank、Mascot形式など）として出力できます。MS-DIALのアルゴリズムを含むパラメータの説明については、http://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/MS-DIAL%20FAQ-vs2.pdfでダウンロード可能な‘MS-DIAL mathematics’も参照してください。

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セクション 1-1

ベンダーのフォーマットをABFに変換するファイルコンバーターのダウンロード

次のサイトに移動 http://www.reifycs.com/AbfConverter/index.html
ダウロード要件とライセンス条項を確認して、コンバーターをダウンロード。 (図2)
* ファイルコンバーターは無料でダウンロードできます。

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セクション1-2

ファイル変換のための条件をチェック

Bruker、LECO、Shimadzu、Thermo、Watersなどのファイルを変換するには、特定のデータアクセスライブラリをPCにインストールする必要があります (表1)。

表1: ファイル変換のために必要なPC条件

Vendor	Formats	Required
Agilent	.D	なし。ただし、ChemstationからのファイルはnetCDFに変換する必要があります。
Bruker	.D	CompassXtract
LECO	.PEG	最初にすべてのPEGファイルをnetCDF (AIA)に変換する必要があります。
Sciex	.WIFF	なし
Shimadzu for GC/MS	.QGD	GCMS solution
Shimadzu for LC/MS	.LCD	LCMS solutions
Thermo	.RAW	MSFileReader
Waters	.RAW	MassLynx Raw Data Reader Interface Library
netCDF	.CDF	Microsoft Visual J# 2.0

FAQ (最新バージョンは以下のサイト参照: http://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/index3.html)

Agilent: Agilentの生データ（.D）のほとんどすべては、追加の手順なしで簡単に変換できます。ただし、唯一の例外は、ChemStationから取得したGCMSデータセットで、これはABFに直接変換することができません。そのため、まずChemStationでファイルをnetCDF（AIA）に変換してください。その後、ダウンロードしたファイルコンバーターを使ってAIAファイルをABFに変換してください。
Bruker: 次のサイトに移動 https://www.bruker.com/service/support-upgrades/software-downloads/mass-spectrometry.html。登録後に、ご使用のオペレーティングシステム環境と互換性のあるバージョン（32ビットまたは64ビット）のインストーラーをダウンロードしてインストールを行って下さい。
LECO: 最初にすべてのデータをnetCDF (AIA) に変換してから、ダウンロードしたファイルコンバーターを使ってABFに変換してください。
Shimadzu: 生データを直接変換した場合は、まずデータを一般的なデータ形式（netCDFまたはmzML）に変換してください。 GC/MSの場合は、GCMS solutionを使用してデータをnetCDFに変換します。 LC-ITTOF/MSの場合は、ProteoWizard（http://proteowizard.sourceforge.net/index.shtml）を使用してデータをmzMLに変換してください。次に、それらをABFに変換します。
Thermo: 次のリンクはMSFileReaderのインストール方法を説明しています： http://fields.scripps.edu/rawconv/ 。GC/MSデータの場合は、まずデータをnetCDFに変換する必要があります。次に、ダウロードしたファイルコンバーターを使ってABFに変換します。 GC-QExactive生データをABFに直接変換できることは確認済みですが、一部のGC/MSデータ（DSQなど）は最初にnetCDFに変換する必要がありました。
Waters: 1. MassLyncs Raw Data Reader Interface Library をダウンロード(http://www.waters.com/waters/supportList.htm?cid=511442&filter=documenttype|DWNL&locale=en_US). 2. アーカイブファイル watersrawsdkredist.zipを解凍し、MassLynxRaw.dll（64ビット）をファイルコンバーターの ABFCvtSvrWtrRwフォルダーにコピーしてください。 32ビット環境は、ファイル変換はまだサポートされていません。
NetCDF: J＃依存関係の問題でエラーが発生したら、以下のサイトからMicrosoft Visual J＃2.0ライブラリをダウンロードしてインストールしてください。

セクション1-3

ファイル変換

“AnalysisBaseFileConverter.exe”を実行
生データをこのプログラムにドラッグ＆ドロップ
右下の“Convert”をクリック
生データと同じフォルダにABFファイルが生成されます(図3)

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セクション1-4

MS-DIALのプロジェクトの立ち上げ

このチュートリアルでは、（1）GC/MS、（2）LC/MSまたはLC/MS/MS（DDA: data dependent acquisition）、および（3）LC/MS/MS（data independent acquisition）の3つのプロジェクトについてパラメータと必要なファイルを説明します。このセクションでは、3つのプロジェクトが要約されており、プロジェクト立ち上げの最小要件がわかります。 LC/MS/MS（DIA）、LC/MS/MS（DDA）、およびGC/MS処理の詳細は、それぞれ第2章、第3章、および第4章に記載されています。

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* 上記のdictionary fileをタブ区切りのテキストファイルとして準備してください
* SWATH data-independent analysisの場合、experiment fileはPeakViewで作成できます（Show->sample information）。列の順序は変更しないでください。“SCAN”は消さないでください。

セクション1-5

CentroidかProfileか？ABFデータの中身

ABFファイルの問題の一つは、データタイプがCentroidかProfileのどちらなのかを自分で決めなければならないことです。データタイプがCentroidの場合、MS-DIALでspectral centroiding処理を実行する必要はありません。一方、Profileデータの場合、MS-DIALでcentroiding処理を実行する必要があります。以下のように、いくつかの機器についてデータタイプを検証しました。（CentroidとProfileの違いは何ですか？：http://blog.acdlabs.com/elucidation/2008/03/what-is-the-dif.html）

✓ SCIEX QTOF: Profile
✓ Thermo Q-Exactive: Profile
✓ Thermo LTQ-Orbitrap: MS1についてはProfile、MS/MSについてはCentroid
✓ All nominal GC/MS data: Centroid

その他の機器については、ABFのデータタイプは、あなたのMS設定によって異なります。

✓ Agilent: MassHunterソフトウェアで出力タイプを”centroid”または”both”に設定すると、ABF converterはデータタイプを‘centroid’として認識します。それ以外の場合は、”profile”と見なされます。

Bruker LC-QTOFとFT-ICR、およびWaters LC-Xevo QTOFとSynapt G2のデータタイプは、ほとんど‘centroid’でした：MS-DIALでは、データタイプとして‘centroid’を選択する必要があります。しかし、まだ保証はありません。

✓ mzML: ProteoWizardプログラムなどでの出力方法によります。

* 実際のプロジェクトを開始する前に、次のようにMS-DIALでデータタイプを確認してください。

どれか一つのファイルを用いて、MS-DIALプロジェクトを”Centroid”モードで始める
MS1とMS2のスペクトラムを”Peak spot viewer”で見て、スペクトラの形を確認する
波形がcentroidingを必要としていると思われる場合、プロジェクトを”Profile”モードで再スタートさせる

セクション1-6

化合物同定のためのデータベース(MSP or Text)

このセクションでは、GC/MSまたはLC/MSデータセットのためのデータベースのフォーマットについて説明します。GC/MS（EI-MS）とLC/MS（ESI-MS/MS）の主な違いは、プリカーサーイオンとそのMS/MSが取得できるかどうかです。プリカーサーの m/z およびそのMS/MSは、ほとんどのESI（または他のソフトイオン化）- MS/MSで取得可能であるが、EI-MS中の分子イオンはハードイオン化のために検出するのが難しいです。いくつかのMSPファイルは、http://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/index.htmlからMS-DIALのスターターキットとしてダウンロードできます。

Section 1-6-1

プリカーサーとMS/MSのライブラリにおけるMSフォーマット

MS-DIALは、ASCIIテキストでMSP（http://www.nist.gov/srd/upload/NIST1a11Ver2-0Man.pdf）形式をサポートしています（下図参照）。さらに、このソフトウェアでは、代謝物の識別に”RETENTIONTIME：”、”PRECURSORTYPE：”、および”FORMULA：”の情報を使用できます(大文字／小文字は区別されない)。可能であれば、保持時間を分単位で指定する必要があります。アダクトイオンの情報、すなわち”Precursor type”は、アダクトイオン検索アルゴリズムで使用されます（セクション７を参照）。

alt 図：MSPフォーマットのライブイラリーの例

セクション1-6-2

アダクトイオンのフォーマット

アダクトイオンの情報は、このセクションで記述するフォーマットに従う必要があります：[M+Na]+, [M+2H]2+, [M-2H2O+H]+, [2M+FA-H]-, 等

イオン情報を囲む括弧は、”[” と”]”を使用します。
”]”の後ろに”+”か”-“の記号を指定して、数字は記号の前に書きます。
C6H12O5のような有機物の化学式を定義したい時は、[M+C2H5COOH-H]や[M+H+(CH3)3SiOH]のように複数要素や括弧なしで書く必要があります。
“2”H2Oのような有機物の化学式の最初の数字は、 H2O × 2として認識されます。これもまた、2(H2O)と指定しないでください。
構造方程式を採用: [2M+H-C6H12O5+Na]2+ (very apt.)
MS-DIALは、以下のようなアダクトタイプの略語または一般的な有機化学式も使用可能です。
アセトニトリル: ACN, CH3CN
メタノール: CH3OH
イソプロパノール: IsoProp, C3H7OH
ジメチルスルホキシド: DMSO
ギ酸: FA, HCOOH
酢酸: Hac, CH3COOH
トリフルオロ酢酸: TFA, CFCOOH

セクション1-6-3

保持時間と正確な質量検索のためのテキスト形式のライブラリ（同定後）

MS-DIALは、保持時間とMS1の正確な質量情報によるピーク同定のためのタブ区切りテキストフォーマットライブラリもサポートしています。この同定処理は、ＭＳＰフォーマットライブラリに基づくピーク同定を完了した後に実行されます。このため、この同定処理を「同定後」と呼びます。最初の行にはヘッダー情報が含まれています。 1列目、2列目、3列目、4列目には、それぞれ代謝物名、正確な質量[Da]、保持時間[分]、およびアダクトイオンを含める必要があります。このライブラリはMicrosoft Excelで簡単に作成できます。スプレッドシートをタブ区切りテキスト形式で保存します。このオプションは、内部標準の同定などに役立ちます（MS/MSライブラリを持っていない場合でも、保持時間と正確な質量に基づくピーク同定はこのオプションから利用できます）。

* このテキストライブラリの最小要件は、単に”metabolite name”と”m/z”の情報です。つまり、最初の2列が必要です。保持時間とアダクトイオンは、それぞれMS-DIALにおけるピーク同定とアダクトイオンピッキングに関する情報を提供します。

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図：テキスト形式のライブラリの例

セクション1-6-4

GC/MSライブリーとしてのMSPフォーマット

MS-DIALは、セクション6-1と同様に、ASCIIテキストでMSPフォーマット（http://www.nist.gov/srd/upload/NIST1a11Ver2-0Man.pdf）をサポートしています。 MS-DIALは、リファレンスの「保持」情報として「RETENTIONTIME：」または「RT」、および「RETENTIONINDEX」または「RI」の2項目を参照します。可能であれば、保持時間情報は分[min]単位で指定する必要があります。

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図：GC/MSのMPSフォーマットライブラリーの例

セクション1-6-5

保持インデックスを計算するためのAlkane-またはFAME保持時間のディクショナリー

保持時間と保持インデックスは、GC/MSを用いたメタボロミクスにおける代謝物の同定に使用されます。現在のMS-DIALプログラムには、保持情報の使用にあたって、3つのオプションがあります。1）保持時間、2）アルカンミックスベースの保持インデックス、および3）FAME（脂肪酸メチルエステル）ミックスベースの保持インデックスです。

アルカンあるいはFAMEを混合した実験の詳細にてういは、下記ページを参照してください。
アルカン: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172311001848
アルカン: https://en.wikipedia.org/wiki/Kovats_retention_index
FAMEs: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2805091/

検出されたピークの保持インデックスを計算するために、ユーザーはタブ区切りのテキストとして炭素数とその保持時間のペアを含む辞書を用意しなければなりません（次ページ参照）。

FAQ

アルカン混合物による保持インデックスの計算は、Kovatsの方法（温度プログラムクロマトグラフィー）に基づいています。
FAME混合では、計算はFiehnの方法に基づいています。重要なことは、炭素数C8、C9、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C24、C26、C28、およびC30のFAME（合計13のFAME）は、Fiehnのインデックスを計算するためにこの辞書に含まれなければなりません。 5次の多項式回帰は、C9からC28の間のクロマトグラフのピークに適用されます。 C8（とそれ以前）とC9の間、およびC28とC30（およびそれ以降）の間のピークは、線形回帰によって補完されます。元のインデックスは、標準品の保持時間（秒）* 1000に基づいています。

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図: アルカンとFamesの辞書

第2章

MS-DIALのLipidBlastデータベース(in silico保持時間および脂質用のMS/MSライブラリ）を使用したLC/MS/MS（data independent MS/MS）プロジェクト

脂質のin silico保持時間およびMS/MSデータベース（MS-DIALのLipidBlast）と組み合わせて、 data independent MS/MSの取得を扱うプロジェクトをデモンストレーションします。実験プロトコルは以前の研究を参照して下さい。：http://www.nature.com/nmeth/journal/v12/n6/abs/nmeth.3393.html.

このチュートリアルは、下記リンクからダウンロードされた23ファイルを使用しています。
http://prime.psc.riken.jp/?action=drop_index

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実験の概要:
液体クロマトグラフィー：Waters Acquity UPLC CSH C18 column (100×2.1 mm; 1.7 μm)を使用して、各サンプルごとに合計15分のラン。
質量分析法: SWATH method、ネガティブイオンモード.
MS1取得時間, 100 ms
MS2取得時間, 10 ms
Collision energy, 45 V
Collision energy spread, 15 V
Cycle time, 731 ms
Q1 window, 21 Da
Mass range, m/z 100-1250

セクション2-1

プロジェクトの立ち上げ

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File -> new project
ABFファイルが格納されているフォルダの絶対パスを指定
method typeとして”Data independent MS/MS’を選択
experimental fileを選択: ABSciex_Experiment_Information_CSH21Da.txt.
“MS1”と”MS/MS”についてdata typeを選択
“negative ion mode”を選択
“target omics”として”lipidomics”を選択
“lipidomics’プロジェクトを選択した場合、MS-DIALにはQTOFMS用のLipidBlastが含まれているため、NIST MSPフォーマットライブラリを準備する必要はありません。
* 詳しくはセクション1-4を見てください

セクション2-2

ABFファイルのインポート

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ABFファイルを選択
ファイルがピークアラインメントの”quality control”サンプルの場合は、そのようにタイプを設定します。

注意：ファイル名は後で変更することはできないので、ここで確定してください。

セクション2-3

パラメーターの設定

セクション2-3-1

Data collectionタブ

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Data collection parameters: 解析範囲（RT軸とMS1軸）を設定できます。このデモでは、予想されるデータ範囲は100-1250 Daに対して0.5-10分です。

Centroid parameters: ピーク検出アルゴリズムが非常に低い域値でMS軸に適用された後、MS-DIALはスペクトルセントロイドを実行します。デフォルトでは、各ピークトップから±0.01と±0.025 Daの範囲のマススペクトルが、それぞれMS1とMS2に統合されています。重要なことは、このMS2許容値は、特定のm/zトレースのMS/MSクロマトグラムを作成する時にも適用されます。 MS/MSクロマトグラムはMS2Decデコンボリューションプログラム専用です。

Isotope recognition: 小さな分子（2000 Da未満）に焦点を合わせている限り、最大荷電数は2に設定できます。一方、プロテオームまたはsnRNAのデータを処理する場合は、パラメータを8以上に変更することができます。

Multithreading: 使用するスレッド数を設定してください。最大スレッド数はリソースモニターで確認できます。（タスクマネージャー->リソースモニター）

セクション2-3-2

Peak detectionタブ

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Peak detection parameters: ピーク検出にはデフォルトで線形加重移動平均（Linear-weighted moving average）が使用され、ピークの左右のエッジが正確に決定されます。推奨されるスムージングレベルは1〜3です。 MS-DIALでは2つの域値（ピーク幅と高さの最小値）を指定できます。これらの閾値を下回るピークは無視されます（MS-DIALで用いる数理モデルについてはhttp://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/MS-DIAL%20FAQ-vs2.pdfも参照してください）。 FT-ICRまたはOrbirapデータの場合、ピークの高さの最小値は50、000以上にするのが良いかもしれません。

Peak spotting parameters: マススライスの幅をここで設定します。我々の経験から、Agilent Q-TOF、AB Sciex TripleTOF、およびThermo Q-Exactiveには0.1または0.05が適しています。カラムまたは溶媒からの不要なm/zピークが既に分かっている場合は、それらを”Exclusion mass list”で指定できます。

下記はhttp://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/MS-DIAL%20FAQ-vs2.pdfからの抜粋

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セクション2-3-3

MS2Decタブ

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“sigma window value”は、デコンボリューションの分解能の影響を大きく受けます。より高い値（0.7〜1.0）はピークトップ分解能を低下させる、つまり、分解されるピークの数は減少します。一方で、より低い値（0.1〜0.3）もまた多くのノイズとなるピークを取得していまいます。

さらに、MSノイズを減らすためにカットオフ値を設定することができます（セクション3-3-3を参照）。最後に、注目したプリカーサイオンの後にプロダクトイオンを削除する場合は（メタボロミクスとリピドミクスに推奨）、”Exclude after precursor ion”にチェックを入れます。

Keep the isotopic ions until: 実際、MS1スペクトルの同位体パターンはしばしば乱されます。一方、MS/MSスペクトルの同位体パターンは、MS1スペクトルの同位体パターンよりも明確な場合があり、分子式の正確なアノテーションに使用できる場合があります。このパラメータを5に設定した場合、MS2Decアルゴリズムが終了した後、プリカーサー+5Daまでのイオンは保持されます。

Keep the isotopic ions w/o MS2Dec: 時々、MS2Decアルゴリズムは数学的問題のためにプリカーサーの同位体イオンを消去するかもしれません。そのため、このオプションによって、プリカーサーの同位体イオンについてのみ加工していないMS/MSスペクトルを保持できます。

セクション2-3-4

Identificationタブ

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MSP file: “lipidomics”プロジェクトを選択した場合、脂質プロファイリングのためにデータセットの中から見つけたい脂質を選択してください。このデモで用いている藻類リピドミクスにおいては、上の図で示している脂質（FA、 lysoPC、 lysoPE、 PA、 PC、 PE、 PG、 PI、 PS、 MGDG、 DGDG、 SQDG）にチェックを入れてください。

Parameters: MSPファイルに保持時間（RT）情報を含める場合は、RT許容値を設定します（デフォルトは0.5）。例えば、我々の脂質DBには、我々の15分LCメソッドに最適化された予測RT情報が含まれています。適切なRT情報が得られない場合は、許容値を100以上に設定します（LC時間よりも長い値を設定して下さい）。
MS1とMS2のmass tolerancesは化合物検索に必要であり、それらは機器の性能に依存します。
identification scoreのカットオフ値は0.7または0.8より大きくなければなりません。

Text file: “post identification”処理を実行する場合は、ここでテキストファイルを指定してください。(このデモの場合: Lipid_Nega_IS_PostIdentification_vs1.txt)

Parameters: パラメータの意味はMSPに基づいた同定と同じです。

Advanced library search option: ライブラリ検索のためのオプションはここで設定します。現在のプログラム（2014/11/30）では、ライブラリ検索には2つのオプションがあります。

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MS/MSタブ:

Relative abundance cut off: ユーザーが定義する値よりも小さいマススペクトルピークは、MS/MSのsimilarity calculationには使用されません。

Post ident.タブ:

Only report the top hit: いくつかのクロマトグラムピークは識別アルゴリズムにより同じ化合物とアノテーションされるので、このオプションにより、多数の結果からidentification scoreに基づいて候補を一つに絞り込むことができます。

セクション2-3-5

Adductタブ

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アダクトイオンの指定: 考慮すべきアダクトイオンとcharge valuesを指定することができます。
* アダクトイオンの決定方法についてはセクション3-3-5の説明も参照してください。

セクション2-3-6

Alignmentタブ

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Parameters: 適切なquality control（QC）データ（通常は混合サンプルデータ）が既にある場合は、ここでQCファイルを指定します。すべてのサンプルデータはこのQCファイルにアラインされます。ピークアライメントに対するRTおよびMS1の許容誤差は、クロマトグラフの条件によって異なります（詳細については、MS-DIAL mathematicsを参照してください）。アライメントで完全に検出されていない特定のピークを削除する場合は、”peak count filter”を指定します。たとえば、チュートリアルデータには、同じピーク情報を持つ少なくとも4つの生物学的反復データが含まれ、データの総数は23です。次に、ピークカウントフィルタを（4/23）∗100 = 17.4％に設定します。これは、欠けている値が17.4％以上含まれているとピークが削除されることを意味します。さらに、”N% detected in at least one group”では、フィルタリングは各サンプルグループ内で行われます。 100％に設定すると、ピークはそのクラスすべてのサンプルで検出されます。
多数のQCサンプルデータを準備することができる場合は、”Detected in all QCs”ボックスをチェックしてください。そうすると、どのQCサンプルにも存在しないピークは、削除されます。

注意: 化合物同定を実行すると、同定結果の代表スペクトルは、インポートされたファイルのうち最も同定スコアの高いものから自動的に決定されます。アライメントスポットがどのサンプルからも認めれない場合、インポートされたファイルの中で最もイオン存在量が多いサンプルのMS/MSスペクトルが代表スペクトルとして割り当てられます。

セクション2-4

偽陽性同定を減らすためのデータキュレーション

MS-DIALは、保持時間、プリカーサー m/z 、同位体比、MS/MSスペクトルについて、サンプルとリファレンスデータベースとの類似度を計算し、それによって自動的に代謝物のピークを同定することができます。しかしながら、残念なことに、ピーク同定の結果には偽陽性の同定も含まれてしまう場合があります。したがって、分析化学者として、結果を手作業でチェックし、特定されたピークを修正する必要があります。もちろん、最終的な目標は、偽陽性および偽陰性のない完全な同定です。
実際にやることは、アライメントファイルの同定結果のキュレーションです。なぜなら、アライメントファイルの同定結果が”peak height”データマトリックスのような最終出力ファイルに反映されるからです。MS-DIALのGUIを使うことにより、アラインスポットが偽陽性/偽陰性の同定結果であるかどうかチェックできます。 MS-DIALのGUIの詳細については、第5章を参照してください。

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第3章

ユーザーが定義したMS/MSデータベースを使用したLC/MSあるいはLC/MS/MS(data dependent MS/MS)プロジェクト

ここでは、ユーザー定義のMSPライブラリ（MassBank、GNPS、およびRespectの統合ライブラリ）と組み合わせたdata dependent MS/MSのプロジェクトについて説明します。実験プロトコルは、過去の研究を参照してください: http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jafc.5b04890。このデモのためのABFファイルは我々のwebサイトからダウロードできます: http://prime.psc.riken.jp/Metabolomics_Software/MS-DIAL/index.html。

このセクションでは合計6つのファイルを使用し、MSPファイルはこのデモの同じフォルダに含まれています。また、すぐに解析がスタートできるようにMS-DIALで使用されるパラメータファイル（Param.med）もこのフォルダの中にあります。

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実験の概要:
液体クロマトグラフィー: 各サンプルにつき計4分間走らせる。Kinetex C18 2.6 μm (50×1.0 mm)を使用。
溶液A: 0.1%酢酸水溶液
溶液B: 0.1%酢酸アセトニトリル溶液
質量分析: data dependentのポジティブイオンモード
Collision energy、 35 V
Collision energy spread、 15 V
Cycle time、 125 ms
Mass range、 m/z 60-1250